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免疫组化染色关键步骤分析

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免疫组化染色


1. 石蜡切片,步骤同前。切片经贴片后,60℃烤片30min使蜡熔化,经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脱蜡。然后,将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min,再放入蒸馏水中3min,水化。

2.脱蜡和水化后,用PBS(pH7.4,具体看所用抗体及染色试剂说明)冲洗3次,每次3分钟。洗瓶冲洗。

3. 根据抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。可选步骤,具体见抗体说明书。

4.每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次,每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。

4. 除去PBS液,每张切片加1滴或50μl的第一抗体,室温下孵育60分钟或4℃过夜,具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次,每次3分钟。

5. 除去PBS液,每张切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂(采用武汉默沙克效果更佳),室温下孵育10-15分钟。PBS冲洗3次,每次3分钟。

6. 除去PBS液,每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液,显微镜下观察3-5分钟(DAB)或37℃环境下10-30分钟(AEC)。

7. 自来水冲洗,苏木素复染10分钟,PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色,则切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,步骤同H-E染色,中性树胶封固;如果用AEC显色,则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。

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